La sua istituzione fu decretata nel 1555 con una bolla di Paolo IV Carafa e sorse, nel quartiere tra Monte Cenci e il Teatro Marcello, piazza Mattei e il Tevere, con tanto di muro e tre porte, dalle quali gli ebrei potevano uscire tra l’alba e il tramonto, solo con permessi speciali e mai di notte. Al tempo di Sisto V (1585-90) il Ghetto è ampliato verso il Tevere e assume l’aspetto di un quadrilatero. Non sono più di tre ettari. Con le piene del Tevere sempre incombenti e al chiuso dal tramonto all’alba, le condizioni igieniche erano spaventose.
Frequenti erano nel Seicento le epidemie per mancanza di fontane pubbliche, tanto che per molto tempo gli ebrei bevvero acqua di fiume. In più si registrava un’interdizione da gran parte dei mestieri e dalla vita pubblica in un’emarginazione totale.
Le mura del “serraglio degli ebrei” verranno abbattute nel 1885.